Mol Psychiatry . 2023 Feb;28(2):871-882. doi: 10.1038/s41380-022-01830-1. Epub 2022 Oct 24.

Induced pluripotent stem cell-derived astrocytes from patients with schizophrenia exhibit an inflammatory phenotype that affects vascularization (統合失調症患者由来の人工多能性幹細胞由来のアストロサイトは、血管新生に影響を与える炎症表現型を示す)

Pablo Trindade ^# 1 2, Juliana Minardi Nascimento ^# 3 4 5, Bárbara S Casas ⁶, Tomás Monteverde ⁶, Juciano Gasparotto ⁷, Camila Tiefensee Ribeiro ⁸, Sylvie Devalle ⁹, Daniela Sauma ¹⁰, José Claudio Fonseca Moreira ⁸, Daniel Pens Gelain ⁸, Lisiane O Porciuncula ⁸, Verónica Palma ⁶, Daniel Martins-de-Souza ^{9 11 12 13}, Stevens K Rehen ^14 15

Abstract

Molecular and functional abnormalities of astrocytes have been implicated in the etiology and pathogenesis of schizophrenia (SCZ). In this study, we examined the proteome, inflammatory responses, and secretome effects on vascularization of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived astrocytes from patients with SCZ. Proteomic analysis revealed alterations in proteins related to immune function and vascularization. Reduced expression of the nuclear factor kappa B (NF-κB) p65 subunit was observed in these astrocytes, with no incremental secretion of cytokines after tumor necrosis factor alpha (TNF-α) stimulation. Among inflammatory cytokines, secretion of interleukin (IL)-8 was particularly elevated in SCZ-patient-derived-astrocyte-conditioned medium (A_SCZCM). In a chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay, A_SCZCM reduced the diameter of newly grown vessels. This effect could be mimicked with exogenous addition of IL-8. Taken together, our results suggest that SCZ astrocytes are immunologically dysfunctional and may consequently affect vascularization through secreted factors.

アストロサイトの分子的・機能的異常は、統合失調症（SCZ）の病因や病態に関与している。本研究では、SCZ患者由来のヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）由来アストロサイトのプロテオーム、炎症反応、血管新生に及ぼすセクレトームの影響を検討した。プロテオーム解析により、免疫機能と血管新生に関連するタンパク質の変化が明らかになった。これらのアストロサイトでは、核内因子κB（NF-κB）p65サブユニットの発現低下が観察され、腫瘍壊死因子α（TNF-α）刺激によるサイトカイン分泌の増加は認められなかった。炎症性サイトカインのうち、インターロイキン（IL）-8の分泌は、SCZ患者由来アストロサイト調整培地（ASCZCM）で特に上昇した。ニワトリ絨毛膜（CAM）アッセイでは、ASCZCMは新しく成長した血管の直径を減少させた。この効果は、IL-8の外因性添加によって模倣することができた。以上の結果から、SCZアストロサイトは免疫学的に機能不全であり、その結果、分泌因子を通して血管新生に影響を及ぼす可能性が示唆される。

• ¹Instituto D’Or de Pesquisa e Ensino (IDOR), Rio de Janeiro, Brazil. pablotrindade@ufrj.br.
• ²Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil. pablotrindade@ufrj.br.

統合失調症(SCZ)は、幅広い行動・認知症状の発現を特徴とする精神病性障害であり、世界人口の約0.5-1%が罹患している。比較的頻度が高いにもかかわらず、この精神疾患の初期の病態生理学はまだよくわかっていない [1] 。診断上、SCZという用語は、異なる重症度の行動または精神医学的変化を含む重複する症状のスペクトルを包括する用語である。SCZに関連する臨床症状の異質性は、本疾患の病因と経過が環境的、心理社会的、遺伝的因子の影響を受けている可能性を示唆している。SCZの症状発現には、神経発達障害 [4] 、神経伝達系の障害 [5] 、多因子性危険因子 [6] など、いくつかの生物学的機序が関係している。SCZ患者における免疫機能障害もまた、潜在的な病因論的メカニズムに対する洞察を与えている。実際、SCZが脳内の免疫反応の障害である可能性を支持する証拠が最近増えてきている。

アストロサイトとミクログリアは中枢神経系（CNS）の主要な免疫応答調節因子であり、分泌されるサイトカインを介して効果を発揮する [9, 10]。シナプス調節やエネルギー代謝におけるアストログリアの役割はよく知られているが、それ以外にも、毛細血管近傍のアストログリアは、脳血管形成を調節し、炎症性サイトカインの重要な供給源となることで、血液脳関門（BBB）の重要な構成要素として働いている [11]。SCZで観察されるアストログリアの変化は、そのほとんどがアストロサイトを介した神経伝達の障害に焦点を当てている [12, 13]。一方、SCZにおけるアストログリアの免疫反応については、まだ十分に明らかにされていない。

炎症は神経変性疾患と精神疾患の両方で観察され、特にSCZで報告されているアストログリアの変化は一様ではなく、しばしば乖離している。例えば、SCZ患者において反応性アストログリオーシスレベルの上昇が報告された報告もあるが [14–16]、同じパラメータに変化がないか、あるいは減少が観察された報告もある [17-19]。この不均一性は、解析した脳部位、SCZの病期、患者の年齢、進行中の治療、症状の重症度などの違いによって説明できる。両者ともSCZでは、血管異常と循環サイトカインの増加が系統的に報告されているが、これらの事象の調節においてアストロサイトが果たす役割は不明である [20, 21]。

前頭前野 [22] 、脳梁 [23, 24]、海馬 [25] などのSCZ患者から採取した特定の脳領域サンプルの死後プロテオーム解析により、2つの共通アストロサイトマーカー、すなわちアルドラーゼC（ALDOC）とグリア線維酸性蛋白質（GFAP）の変化が明らかになった [26, 27]。妄想型統合失調症患者の脳では、残存型SCZ患者の脳よりもS100カルシウム結合蛋白β（S100β）の濃度が高く、炎症が異なる症状と関連している可能性が示唆されている [29, 30]。しかし、SCZスペクトラム障害の神経生理学的側面に関する広範な文献があるにもかかわらず、SCZにおける細胞特異的変化やアストログリアの変化 に焦点を当てた研究はほとんどない。

患者由来の人工多能性幹細胞（iPSC）の開発が進み、SCZ発症に関連する免疫機能障害の影響に光が当てられている［31］。ヒトiPSC（hiPSC）またはSCZ患者由来のhiPSC由来神経細胞を用いた研究では、高レベルの活性酸素種がSCZに関連した行動異常の存在と関連していることが示された［32–35］。さらに、SCZ患者由来のhiPSC由来グリア前駆細胞をマウスにキメラ移植したところ、アストログリア分化の遅延と大脳皮質への異常な遊走が認められた[36]。SCZ患者由来のhiPSC由来アストロ 細胞をインターロイキン（IL）-1βに暴露したところ、T細胞のリクルートに関連するシグナル伝達経路の障害が観察された [37]。

以前の研究で、我々のグループは、SCZ患者のhiPSC由来の神経幹細胞（NSCs）の条件培地によって血管新生が影響を受けることを示した［38］。さらに最近、腫瘍壊死因子α（TNF-α）で刺激したhiPSC由来のアストロサイトが、反応性アストログリオーシスに関連する正準事象を再現できることを示した [39]。これらの先行研究を基に、本研究の目的は、SCZ患者由来のhiPSC由来アストロサイトのプロテオーム、炎症反応、および血管新生に対するセクレトームの影響を調べることであった。SCZ患者由来アストロサイト調整培地（A_SCZ CM）と対照被験者由来アストロサイト調整培地（A_CTR CM）をニワトリ絨毛膜（CAM）アッセイで比較し、SCZ患者由来培養hiPSC由来アストロサイトから分泌されるサイトカインが血管新生に及ぼす影響を評価した。さらに、A_SCZ CMで得られたCAMの結果を、外因性サイトカイン添加で得られた結果と比較し、SCZの状況においてサイトカインが血管新生を阻害する効果があるかもしれないという仮説を検証した。

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Discussion

ここで我々は、SCZと診断された患者から得られたhiPSC由来のアストロサイトが、そのセクレトームに広範な影響を及ぼす慢性炎症プロフィールを示すことを示した。神経炎症がSCZの病因に大きく関与していることを示唆する証拠は数多くある（総説は文献[49]を参照）。プロテオーム解析とサイトカインアレイ解析の結果、血管新生シグナルの経路に変化がみられ、ケモカインIL-8がSCZに関連した血管機能障害の主要な候補であることが明らかになった。我々は、SCZ hiPSC由来アストロサイトにおいて、TLR8やヒト白血球抗原（HLA）-A発現の変化を含む、免疫系関連タンパク質の変化を発見し、SCZ患者の末梢血細胞におけるTLR8活性の亢進という以前の観察結果を裏付けた[50]。一方、ゲノムワイド関連研究では、SCZとHLA発現の多型または変化との関連が明らかにされている [51-53] 。

アストロサイトマーカーであるALDOCとGFAPについては、対照群とSCZ患者との間に有意な差は認められなかったが、これらのタンパク質はSCZの死後研究において影響を受けていることが報告されている[26, 27]。我々の研究は、死後脳ではなく、hiPSC由来のアストロサイトに基づいていることから、死後SCZ脳で観察された変化は、アストロサイトと他の細胞型とのより複雑な相互作用を反映しているのかもしれない。

インタラクトームマップでは、NFKB1とRELA（p65）の両方が、SCZアストロサイトで影響を受けている可能性の高い免疫関連タンパク質の標的であると予測され、カスケードシグナル伝達における極めて重要なハブを示している。この結果は、SCZアストロサイトにおけるNF-κB p65サブユニットレベルの低下や、死後のSCZ脳サンプルで見つかったNF-κB経路の異常という、これまでの観察結果と一致している [54] 。我々のSCZアストロサイトは構成的にNF-κB p65が減少していたが、A_SCZ CMでは炎症性サイトカインと調節性サイトカインの量が増加しており、TNF-α暴露後にNF-κB p65の核内転位が観察された。NF-κB1前駆体は成熟したp50サブユニットにプロセシングされ、p65と結合してNF-κB活性化経路の主要なヘテロ二量体を形成する。NF-κBサブユニット間で形成されうるいくつかのNF-κB二量体構造（ホモ二量体を含む）のうち [55]、p50/p65ヘテロ二量体がグリアにおけるNF-κBの優勢な活性化形態であると考えられている [56]。SCZのアストロサイトにおけるNF-κB二量体の構成について、さらなる研究が必要である。

サイトカインの不均衡は、SCZで頻繁に報告されている [57]。NF-κB p65の発現が低いにもかかわらず、A_SCZ CMでは、TNF-αで刺激したA_CTR CMと同様に、炎症性サイトカインと調節性サイトカインの量が増加していた。IL-6を除いて、TNF-αで刺激したSCZ hiPSC由来アストロサイトはサイトカインの増加を示さなかった。このことは、これらの細胞がTNF-αに応答できない活性化された状態をとることにつながる可能性がある。SCZ hiPSC由来アストロサイトが示すこの慢性的な免疫活性化は、負のフィードバック制御を介して、これらの細胞のNF-κB経路にも影響を及ぼす可能性がある。これらの結果は、SCZ hiPSC由来アストロサイトがIL-1β刺激に対するCCL20応答の障害を示し、制御性T細胞の遊走と脳の炎症に影響を及ぼす可能性を示したAkkouhら[37]の知見を裏付けるものである。

アストロサイト調整培地の解析から、TNF-αは、SCZ hiPSC由来アストロサイトの免疫制御に関連するいくつかの経路や機能の調節に適度な影響を及ぼすことが示された。しかし、セクレトームの主成分分析から、TNF-αで刺激されたSCZ hiPSC由来アストロサイトは、TNF-αで刺激されなかったSCZ hiPSC由来アストロサイトと、TNF-αに暴露された対照被験者hiPSC由来アストロサイトとで、非常に密接にクラスター化していることが明らかになった。以前、われわれは、SCZ被験者のhiPSC由来NSCsの条件培地が、血管新生因子の分泌と発現に障害を示すことを示した［38］。Windrem博士と共同研究者らは、SCZ患者のhiPSC由来グリア前駆細胞が、シナプス制御とグリア分化に関連する標的遺伝子の発現に障害を示すことを示した。さらに、SCZ hiPSC由来のグリア前駆細胞をマウスの脳梁に異種移植したところ、アストロサイトの分化が遅延し、in vivoでの行動学的および電気生理学的な影響と関連することが明らかになった［36］。分化プロトコルの技術的な違いはあるものの、WindremとCasasの研究で使用されたhiPSC由来細胞はいずれもグリア前駆細胞であり、SCZの脳発達過程においてグリア細胞系譜が本質的に破壊されている可能性を示唆している。これらのデータを総合すると、成人の脳でしばしば観察され[58]、アストロサイトにおける遺伝子制御と本質的に関連している[59]、SCZに伴う神経炎症経路の制御異常は、発生期に何らかの起源があることが示唆される[60]。

分泌タンパク質は、SCZアストロサイトの制御異常が細胞微小環境にどのような影響を及ぼすかについての手がかりを与えてくれるかもしれない。例えば、TGFB2、NRP2（糖タンパク質ニューロピリン）、PKM（ピルビン酸キナーゼ2）、SOD2（スーパーオキシドジスムターゼ）などのタンパク質が同時にアップレギュレーションしていることから、細胞運動、血管新生、血管新生が影響を受けている可能性が示唆される。特筆すべきは、これらのタンパク質のいくつかが血管や神経の発達に関与していることである [61, 62]。ニューロピリンは、軸索の形態形成 [63] と血管新生 [64] の両経路において、またセマフォリンやVEGFと関連して、共受容体として働く。ここでは、hiPSC由来のアストロサイト調整培地を用いたすべての実験群で、ニワトリ胚の血管新生が増加することが観察され、アストロサイトが中枢神経系における血管新生因子の重要な供給源であるという仮説が支持された [65]。血管新生のレベルが高く、血管の口径が小さいという我々の所見は、A_SCZ CM

A_CTR CMを用いた場合よりも、アストロサイトがSCZにおける血管新生の阻害に主要な役割を果たしている可能性を示唆している。一方、我々は以前、SCZ NSCs の条件培地が弱い血管新生誘導を示すことを示した [38]。アストロサイトと比較して、NSCsはわずかに炎症反応を示すと予想される。さらに、成体NSCsには潜在的な炎症性があり、神経新生を促進するために慢性的に抑制されている [66] 。したがって、SCZアストロサイトによって誘導される血管新生の増加は、炎症性 の破壊の副産物である可能性が示唆される。

血管の変化はSCZの一般的な特徴である [67, 68]。神経画像研究の 著者らは、SCZにおける微小血管系の異常について記述しており、その中には 、前頭前野における毛細血管面積密度の減少が含まれるが、視覚野では含まれない [69] 。網膜では、 SCZでは静脈の幅が広いことが報告されている [70, 71]。これらの血管の変化は、SCZと診断された患者における皮質の厚さの減少と相関している [72]。血管口径の調節は、血流に影響を与えることで、 局所の神経回路に影響を与える可能性がある。SCZは、視床、小脳、線条体、大脳皮質 における血流のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションと関連していることが報告されている。SCZにおける中枢神経系血管の広範かつ異なる分布の変化は、これらの領域にわたる異なるアストロサイト の集団の生理学的側面に関するさらなる研究の必要性を強調している。

ケモカインであるIL-8は、SCZのアストロサイトで高くなっていることがわかったが、血管新生によく関連する小口径血管 を含め、A_SCZ CMと同様の方法で血管形成を増加させるのに十分であった [48]。妊娠中のIL-8レベルの上昇は、成人した子供におけるSCZのリスク上昇と関連している [77–79]。未治療のSCZ患者の血漿中にも、IL-8、IL- 6およびIL-2が高値で観察されている [80-82]。このケモカインは、炎症時のリンパ球や好中球の強力な走化性因子 [83]であり、 アルツハイマー病 [84] やうつ病 [85] など、さまざまな脳の病態に重要な役割を果たす可能性がある。IL-8は周皮細胞に作用し、炎症刺激によって活性化されると好中球を化学吸引することが示された [86]。IL-8の脳脊髄液内注射は、脳 の損傷後のBBB機能障害と関連している [87]。さらにIL-8は、内皮細胞の生存と増殖を促進する栄養因子として同定されており、 血管新生促進因子としても同定されている [88, 89]。したがって、IL-8がBBBに作用することで、循環する免疫担当細胞がCNSにアクセスできるようになり、SCZにおける神経炎症と血管の変化の中心的な担い手となる可能性がある。SCZ患者の末梢血中好中球数の増加 [90, 91] および好中球対リンパ球比の上昇 [92] は、この可能性を支持するものである。興味深いことに、抗精神病薬はSCZにおいて好中球対リンパ球比を低下させることが報告されている [93] 。循環免疫細胞とアストロサイトとの相互作用を、 BBB完全性の影響とは別に、SCZの状況で解明することで、潜在的な治療標的が明らかになるかもしれない。

結論として、我々の知見は、NF-κBの機能障害とサイトカイン分泌の上昇によって証明される、アストロサイトに影響を及ぼす内在性の神経炎症性の不均衡が、少なくとも 、SCZ発症における脳の変化を形成する発達障害の根底にある可能性を示唆している。われわれの研究はサンプル数が少ないという制約があるが、3人の統合失調症患者のiPS細胞から得られたアストロサイトは、症状の不均一性とは無関係に、炎症性表現型のプロフィールを示した。したがって、われわれの研究の強みは、アストロサイトから特異的に分泌されるサイトカインが統合失調症における血管障害の一因であることを見出したことである。この関連性が精神分裂病の発症に影響を及ぼすかどうかは、 。したがって、本研究は、ここで示唆された関連性が一貫した数のSCZ患者において一般的であるかどうかを検証するために、より大規模なサンプルを用いた更なる研究に貢献する仮説構築的研究である。つまりIL-8が脳血管網に影響を与え、その微小環境を破壊する可能性のある因子であることが確認された。