Nature Neuroscience volume 22, pages374–385 (2019)
Published: 04 February 2019
Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning (統合失調症患者由来のシナプス刈り込みモデルにおけるミクログリアによるシナプス除去の増加)
Carl M Sellgren 1 2 3, Jessica Gracias 4 5 6, Bradley Watmuff 4 5, Jonathan D Biag 7, Jessica M Thanos 4 5, Paul B Whittredge 7, Ting Fu 4 5, Kathleen Worringer 7, Hannah E Brown 4 5, Jennifer Wang 4 5, Ajamete Kaykas 7, Rakesh Karmacharya 4 5 8, Carleton P Goold 7, Steven D Sheridan 4 5, Roy H Perlis 9 10
1Center for Quantitative Health, Center for Genomic Medicine and Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA. carl.sellgren@ki.se.
2Department of Psychiatry, Harvard Medical School, Boston, MA, USA. carl.sellgren@ki.se.
3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden. carl.sellgren@ki.se.
4Center for Quantitative Health, Center for Genomic Medicine and Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA.
5Department of Psychiatry, Harvard Medical School, Boston, MA, USA.
6Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden.
7Novartis Institutes for BioMedical Research, Cambridge, MA, USA.
8Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, Belmont, MA, USA.
9Center for Quantitative Health, Center for Genomic Medicine and Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA. rperlis@mgh.harvard.edu.
10Department of Psychiatry, Harvard Medical School, Boston, MA, USA. rperlis@mgh.harvard.edu.
Abstract
統合失調症患者の死後大脳皮質組織では、シナプス密度が低下しており、シナプス除去が増加していることが示唆される。我々は、ミクログリアが介在するシナプス刈込のn vitroモデルを再プログラムし、患者由来の神経培養液と単離したシナプトソームにおいて、シナプスの除去が増加していることを実証した。この過剰なシナプス刈り込みは、ミクログリア様細胞およびシナプス構造の両方の異常を反映している。さらに、ヒト補体成分4(C4)遺伝子座の統合失調症リスク関連変異は、神経細胞の補体沈着とシナプス除去の増加と関連しているが、シナプス除去の増加の観察結果を完全に説明するものではないことを明らかにした。最後に、電子記録から抽出した若年成人のコホートにおいて、抗生物質ミノサイクリンがin vitroでミクログリアを介したシナプスの取り込みを減少させ、その使用が他の抗生物質と比較して統合失調症の発症リスクを緩やかに減少させることと関連していることを実証した。これらの知見は、過剰な刈り込みが、高リスク者における統合失調症の発症を遅延または予防するための潜在的な標的であることを示唆している。
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図1. a, Representative phase-contrast image of iMG cells captured during a live imaging session (repeated in 3 independent experiments with 36 images collected per session and similar results). Scale bar, 20 μm. b, Confocal images of iMG cells stained for TMEM119, P2RY12, and PU.1. Images are representative of 3 independent experiments with 20 images collected per experiment. Scale bar, 20 μm. c, Spine density (spines per 10-μm dendrite) in an iPSC-derived neural line with and without coculture with iMG cells (derived from 2 individuals) for 48 h (n = 40 randomly selected dendrites examined per group). Data are normalized to neural culture only and were analyzed using a t test (equal variance); t(78) = 3.40, P = 0.001 (two-sided). Mean ± s.e.m. is indicated for each group. d, Phalloidin 488-stained dendrite of an iPSC-derived neuron in pure culture and cocultured with iMG cells for 48 h.; arrows indicate dendritic spines. Images are representative of the experiments described in c. Scale bar, 10 μm. e, Colocalization and engulfment of PSD-95 (red) by iMG cells (green, CD68) in coculture. Images are representative of 3 independent experiments with 20 images collected per experiment. Scale bar, 30 μm.
Discussion
細胞初期化法を用いて、SZ患者および慎重に適合させた定型発達者におけるシナプス刈り込みの患者特異的in vitroモデルを作成することにより、SZ由来のiMG(誘導ミクログリア)培養において、シナプスおよびiMG細胞の効果により、シナプス構造の補体依存的除去が増加することを証明した。注目すべきは、これらの効果がC4遺伝子座のヒトSZリスク変異に完全に起因するものではないことである。このような変異は、ニューロンへの補体沈着の増加や、iMG細胞によるシナプス構造の取り込みの増加と関連している。その後、ミノサイクリンは用量依存的に、シナプス構造の除去を抑制した。さらに、予備的な概念実証のためのEHRコホート研究において、思春期におけるミノサイクリンの使用は、精神病の発生率を控えめながら有意に減少させることと関連していた。
患者由来の細胞を用いた我々の実験データは、SZ患者に観察される構造的・機能的障害を説明する潜在的なメカニズムを提供するものである。SZ患者における皮質灰白質容積の減少は、繰り返し観察されている41。シナプス密度の低下は死後資料から報告されており11,12,13、機能的磁気共鳴画像検査では脳の機能的結合の異常が認められている8,9,10,41。さらに、「リスクのある」青年期または成人期早期の集団の研究では、精神病への「転換者」において灰白質の厚さが加速的に減少するという強い証拠が示されている2,3,4,5,6,7。これは、観察された構造異常が病気への移行時にすでに存在し、所定の年齢間隔での皮質の成熟障害と関連している可能性が高いことを示唆している。補体シグナルに依存するミクログリアは、シナプス刈り込みに主要な役割を果たすことが齧歯類の研究で証明されており17,18,42、思春期の人間の神経発達の顕著な特徴14。
今回の結果は、ゲノムワイド関連データのメタ解析において、SZと最も強く関連する遺伝子座には、ヒトC4AおよびC4B遺伝子の構造的に異なる対立遺伝子が関与し、リスクは少なくとも部分的にC4Aの発現増加（最もC4AL CN）と関連しているという過去の報告と一致するが、完全には説明できない1,16。我々は、これらの変異体がシナプス構造への補体沈着の増加と関連していることを発見した。特に、ヒトiPSC由来の神経株における構造的C4対立遺伝子を調べることにより、C4AL CNと神経細胞の補体沈着（C3）の関連を確認した。C4BL（C4B発現に主に影響）またはC4BS（C4B発現のみに影響）には有意な効果は観察されない。同様に、貪食アッセイでは、神経細胞株におけるC4ALのCNが大きいほど、iMG細胞によるシナプス構造の取り込みが増加し、SZ神経細胞培養におけるC3-C3受容体相互作用を阻害すると、iMG細胞によるスパイン密度の低下が劇的に減少した。しかし、C4遺伝子座の遺伝的変異では説明しきれない貪食の違いが見出された。したがって、この結果は、C4遺伝子座のSZリスク変異が、C4Aを介した神経細胞補体の過剰沈着を引き起こし、それがミクログリアによるシナプスの巻き込み増加の一因であるが、唯一の要因ではない、というモデルを示唆している。
iMG株ではC4リスク変異の明確な影響は見られなかったが、患者由来のモデルを通じて、iMG細胞による貪食、およびSYNsの貪食にSZに関連した差異があることを検出した。この結果は、SZのリスク1が多因子であることを示すとともに、SZ患者におけるシナプス刈り込みの異常には、いくつかの独立した要因が関与していることを示唆しています。さらに、iMG細胞を抗生物質ミノサイクリンで前処理することにより、SYNの取り込みが用量依存的に減少することが確認されました。このヒトモデルシステムにおける最初の観察は、ミノサイクリンを投与したマウスで網膜神経節細胞の入力の取り込みが減少したことを報告した以前の動物実験と一致する。iMG細胞によってin vitroで模倣できることが以前に示されたミクログリア機能である生存中のNPCの巻き込みは、誘発されたてんかん状態によって歯状回顆粒下帯の前駆細胞の数が増加するネズミモデルを用いてミノサイクリンによっても阻害される。一方、ミノサイクリンは、炎症性サイトカイン45の分泌を抑制するものの、前駆体タンパク質トランスジェニックマウス45におけるアミロイドβ線維の貪食を減少させず、さらにポリノシン酸：ポリシチジル酸マウスから分離した成海馬ミクログリアによるラテックスビーズの取り込みの減少を救済する。これらのことから、ミノサイクリンは、活性化状態や与えられた基質などの因子が極めて重要であるにもかかわらず、非常に複雑であるが解剖可能な方法でミクログリアの貪食機能に影響を与えることが明らかになった。
筆者らの調査では、思春期に非テトラサイクリン系抗生物質ではなく、ミノサイクリンまたはドキシサイクリンに慢性的にさらされると、精神病発症のリスクが低下することが明らかになった。非ランダム化、自然主義的コホートから外挿することの難しさを考慮すると47,48、この予備的知見は、前向きランダム化試験で確認する必要がある。これまでの臨床研究では、小規模な臨床調査においてミノサイクリンの効果はまちまちであったが、重要なことは、これらの研究は慢性SZ患者における急性期の有効性を調べたに過ぎないということである。より一般的には、我々が説明したモデルは、シナプス刈り込みを減少させる潜在的な標的の同定を目指す創薬研究を促進し、この慢性的で障害のある障害を予防するための最初の実証的手段となり得るものである。
本研究のいくつかの限界は、強調されるべきである。第一に、ヒト生体外ミクログリアのトランスクリプトームシグネチャーは、in vitroではかなり急速に変化する19。iMG細胞は、最近のiPSC由来ミクログリア様細胞や初代培養ミクログリアと同様に、脳の微小環境を模倣する条件を調整しても、ヒト生体外ミクログリアの分子シグナルを十分に再現することはできない。第二に、iPSC由来の神経培養におけるスパインの構成は、生体内の条件を完全に再現できない可能性がある49,50. しかし、これらの制約にもかかわらず、iMG細胞を用いた我々のin vitroアッセイは、齧歯類モデルを用いてin vivoで観察されたメカニズムを再現することができた20。また、本研究では、in vitroで観察されたミノサイクリンの効果が、登録ベースの分析で観察されたSZの発症率の低下をそれ自体で引き起こしていることを裏付ける直接的な証拠を欠いていることも注目に値する。仮にこの効果が確認できたとしても、我々の健康記録研究におけるミノサイクリンの曝露時期は、シナプス刈り込みによる皮質の成熟と重なるため、ミノサイクリンが、まだ特定されていない別のメカニズムによって精神病への移行リスク（本研究では、ハザード比に基づき、〜40％のリスク低下）をわずかに低下させている可能性も十分にある。
しかし、全体として我々の研究は、SZにおけるシナプスの排除の増加を支持し、既知の遺伝的リスク変異と疾患初期に観察される脳の構造的変化とを結びつけるメカニズムを提供するものである。ミクログリアによるシナプスの除去を標的とした薬理学的介入は、高リスク者におけるSZの発症を遅延または予防する可能性があり、さらなる研究に値する。
図4．a, ‘Pure’ disease models, derived from patients with SZ, were compared to ‘mixed’ models in which the same synaptic structures from SZ patients were added to iMG cells derived from matched HCs, as well as ‘pure’ HC models compared to ‘mixed’ models in which the same synaptic structures from HC patients were added to iMG cells derived from matched SZ patients. For both experimental designs, as a reference, we included matched ‘pure’ HC and SZ models, respectively. b, Quantification of pHrodo (red)-labeled SY) uptake in iMG cells during live imaging sessions of 5 h. SZ-SZ models were based on SYN from 2 SZ patients and iMG cells from 8 SZ patients (n = 8 models), while SZ-HC models were based on the same SYN from SZ patients and 8 models based on iMG cells derived from 7 matched HCs (n = 8 matched models). HC-HC models were based on iMG cells from 8 HCs and SYN from 3 HCs (n = 8 matched models). Nine images (20×) per well were automatically acquired every hour and the means were then extracted and analyzed using a two-way repeated ANOVA. There was a significant interaction between the effects of time and group on the phagocytic index (F(10,105) = 3.07; P = 0.0018). Šidák’s multiple comparison tests (across the three groups at every time point) gave an adjusted significant P value of 0.005 at 4 h for the SZ-SZ group versus the HC-HC group, and at 5 h for comparison of the SZ-SZ group versus the HC-HC group (P < 0.0001), as well as the comparison of the SZ-SZ group and the SZ-HC group (P = 0.042). All other comparisons were non-significant. c, Representative live images (5 h) from SZ-SZ, SZ-HC, and HC-HC models in the experiments described in b. d, Identical live imaging design as in b but in this experiment comparing HC-HC models (based on SYNs from 3 HCs and iMG cells from 5 HC patients; n = 7 models), with HC-SZ models based on the same SYN from HCs but iMG cells derived from 3 matched SZ patients (n = 7 matched models). SZ-SZ models were based on iMG cells from 7 SZ patients and SYNs from 3 SZ patients (n = 7 matched models). Data were analyzed using a two-way repeated ANOVA. There was a significant interaction between the effects of time and group on the phagocytic index (F(10,90) = 3.89; P = 0.0002). Šidák’s multiple comparison tests (across the three groups at every time point) revealed a significant different in phagocytic indexes at 3 h between the SZ-SZ group and the HC-HC group (adjusted P value = 0.031) as well as between the HC-HC group and the HC-SZ group (adjusted P value = 0.041). The mean difference was also stable for these comparisons at 4 h (SZ-SZ versus HC-HC: P = 0.0008; HC-HC group versus HC-SZ: P = 0.011) and at 5 h (SZ-SZ versus HC-HC: P < 0.0001; HC-HC group versus HC-SZ: P = 0.023). All other group comparisons were non-significant. e, Representative live images from the different combinations in d. Scale bar, 25 μm. f, Quantification of phagocytic inclusions (PSD-95+ inclusions, 0.5–1.5 μm) using confocal microscopy and SYNs derived from 2 neural SZ lines matched with iMG cells from 6 SZ patients or 6 matched HCs (n = 6 models per group) with representative confocal images in g; scale bar, 30 μm. Wilcoxon signed-rank test: P = 0.031. h, Quantification of PSD-95+ inclusions using confocal microscopy and SYNs derived from 3 neural HC lines matched with iMG cells from 6 HCs or 6 matched SZ patients (n = 14 models per group), with representative confocal images in i; Scale bar, 30 μm. Wilcoxon signed-rank test: P = 0.017. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. All reported P values are two-sided. Mean ± s.e.m. is indicated in b and d; the median with the interquartile range is shown in f and h.
