Sci Rep. 2022 Oct 12;12(1):17114. doi: 10.1038/s41598-022-21488-7.

PSD-95 in the anterior cingulate cortex contributes to neuropathic pain by interdependent activation with NR2B (前帯状皮質のPSD-95はNR2Bと相互依存的に活性化し、神経障害性疼痛に寄与する)

Ang Li # 1, Chang-Jun Huang # 1 2, Kai-Peng Gu 1, Yan Huang 1, Ya-Qin Huang 1, Hui Zhang 1, Jia-Piao Lin 1, Yu-Fan Liu 1, Yan Yang 3, Yong-Xing Yao 4

Affiliations

• ¹Department of Anesthesia, First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 79 Qingchun Road, Hangzhou, 310003, China.
• ²Department of Anesthesia, First People’s Hospital of Linping District, Hangzhou, China.
• ³Department of Neurobiology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, China.
• ⁴Department of Anesthesia, First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 79 Qingchun Road, Hangzhou, 310003, China. yaoyongxing@zju.edu.cn.

^#Contributed equally.

浙江大学医学院

浙江大学（せっこうだいがく、ピンイン：Zhèjiāng Dàxué, 英称：Zhejiang University）は、中華人民共和国浙江省杭州市西湖区に所在する国立大学である。1897年に求是書院（ピンイン：Q­íushì Shūyuàn）として設立された。 九校連盟、985工程、211工程、双一流の成員校として、教育部が直轄する国家重点大学である。略称はZJUおよび浙大。(Wikipedia)

Abstract

Studies suggest that the scaffolding protein, postsynaptic density protein-95 (PSD-95), is involved in multiple neurological dysfunctions. However, the role of PSD-95 in the anterior cingulate cortex (ACC) in neuropathic pain (NP) has not been investigated. The current study addressed the role of PSD-95 in the ACC in NP and its modulating profile with NMDA receptor subunit 2B (NR2B). The NP model was established by chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve, and mechanical and thermal tests were used to evaluate behavioral hyperalgesia. Protein expression and distribution were evaluated using immunohistochemistry and western blotting. The results showed that PSD-95 and NR2B were co-localized in neurons in the ACC. After CCI, both PSD-95 and NR2B were upregulated in the ACC. Inhibiting NR2B with Ro 25-6981 attenuated pain hypersensitivity and decreased the over-expression of PSD-95 induced by CCI. Furthermore, intra-ACC administration of PSD-95 antisense oligonucleotide not only attenuated pain hypersensitivity but also downregulated the NR2B level and the phosphorylation of cyclic AMP response element-binding protein. These results demonstrated that PSD-95 in the ACC contributes to NP by interdependent activation of NR2B.

シナプス後密度タンパク95（PSD-95）は、様々な神経機能障害に関与していることが示唆されている。しかし、神経因性疼痛（NP）における前帯状皮質（ACC）のPSD-95の役割については、これまで検討されていない。本研究では、神経因性疼痛におけるACCのPSD-95の役割と、NMDA受容体サブユニット2B（NR2B）による調節プロファイルを取り上げる。ラット坐骨神経の絞扼性神経損傷（CCI）によりNPモデルを確立し、機械的および熱的試験により行動学的な痛覚過敏を評価した。タンパク質の発現と分布は、免疫組織化学とウェスタンブロッティング法で評価した。その結果、PSD-95とNR2BはACCの神経細胞で共局在していた。CCI後、PSD-95とNR2BはともにACCで発現が上昇した。Ro 25-6981でNR2Bを阻害すると、痛覚過敏は減弱し、CCIによるPSD-95の過剰発現は減少した。さらに、PSD-95アンチセンスオリゴヌクレオチドをACC内に投与すると、疼痛感受性が減弱するだけでなく、NR2Bレベルおよびcyclic AMP response element-binding proteinのリン酸化が抑制されることが確認された。これらの結果は、ACC の PSD-95 が NR2B の相互依存的な活性化によって NP に寄与していることを証明するものであった。

〇絞扼性神経障害モデルー1998年 Bennet, et al。一側の坐骨神経を4-0 chromic gutで4回ルーズに絞扼して神経を損傷する。

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Discussion

本研究では、ACC における PSD-95 と NR2B の分布と、NP におけるそれらの潜在的な役割について検討した。NR2B は神経細胞で発現しており、PSD-95 は NR2B とよく共局在していることが判明した。CCI後、NR2BとPSD-95の発現はともに増加し、行動過敏と一致した。NR2B の機能阻害あるいは PSD-95 の発現をノックダウンすると CCI による痛覚過敏が減弱したことから、ACC における NR2B と PSD-95 は痛覚過敏の発生に重要な役割を果たすことが示唆された。さらに、Ro 25-6981 は PSD-95 の過剰発現を抑制したが、PSD-95 AS-ODN は NR2B の過剰発現も抑制し、NR2B と PSD-95 は NP の過程で相互に依存的に活性化されていることが示唆され た。さらに、PSD-95ノックダウン後、CREBの活性化も抑制されたことから、CREBはACCにおけるPSD-95の下流標的である可能性が示唆された

ACCは、情動・感情的要素に重要な役割を果たすと認識されているが、痛みの感覚・識別的要素におけるその役割については、ほとんど知られていない27,28。しかし、近年、ACCは痛みの感覚・識別成分の調節に関与する領域として浮上しており、ACCが情動・感情成分に加えて感覚成分にも関与していることが示唆される29,30。本研究では、ACCにおけるCXCR3阻害が痛みを改善するという我々の以前の発見10と同様に、NR2Bの薬理学的阻害またはPSD-95のノックダウンが末梢神経損傷誘発性NPを減弱させ、痛みの調節におけるACCの重要な役割が示唆された。この知見は、慢性疼痛状態において、ACCから脊髄後角への下行性促進経路が活性化され、緊張性促進を介して疼痛伝達が増強されるという最近の知見からも支持された31,32。しかし、本研究で見出された鎮痛効果が、そのような経路の障害に起因するものかどうかについては、さらなる研究が必要である。

CCI後の疼痛調節におけるACCのNR2Bの役割をさらに検討するため、ACCにおけるNR2Bの薬理学的阻害をマイクロインジェクションにより実施した。その結果、NR2Bを阻害すると、CCIによる行動性痛覚過敏が減弱することがわかり、ACCにおける痛み知覚にNR2Bが重要な役割を担っていることが示唆された。しかし、Ro 25-6981でNR2Bを拮抗させた後、熱知覚は機械的知覚よりも敏感であるように思われた。脊髄のNR2B-PSD-95相互作用の摂動は、神経損傷、悪性腫瘍、糖尿病のいずれかによって誘発される熱的・機械的痛覚過敏を減弱させると報告されているが、これらの操作で2種類の侵害受容の間に明らかな違いは見られなかったことから、この2種類の侵害刺激による痛覚過敏において脊髄NR2BとPSD-95は同様の役割を果たすと考えられた22,33,34。また、ACCからの投射を受ける軌跡神経細胞を光遺伝学的に活性化すると、ラットの熱侵害受容に双方向の変化が生じることが示されており、ACCと他の脳領域間の熱優位性神経回路がこの不一致に寄与している可能性が示唆されている35,36。

PSD-95は、後グルタミン酸ニューロンの樹状突起スパインに存在する足場タンパク質で、NR2AまたはNR2B受容体サブユニットと相互作用し、AMPAおよびNMDA受容体の集積とシナプス標的化に重要な役割を担っている37。ACC では、PSD-95 はいくつかの神経疾患との関わりが示唆されています38,39。錐体細胞は主要な神経細胞種の一つとして、その膜上にNMDA受容体を発現しており、NMDA受容体は様々な体性・内臓性侵害刺激の調節に関与している40,41。本研究では、PSD-95はNR2Bとよく共局在しており、CCIは脊髄における片側の変化とは逆に、ACCにおいてPSD-95とNR2Bの両側のアップレギュレーションを誘発することを見いだした40。この違いは、前白交連の脊髄視床路と対側の疼痛伝達部位からACCへの求心性投射がクロスオーバーしているためかもしれない42,43。ACCにおけるPSD-95の疼痛調節における役割を探るため、AS-ODNを投与し、その発現をノックダウンした。行動テストにより、PSD-95ノックダウンが痛覚過敏を抑制することが明らかになった。一方、ウェスタンブロッティングにより、NR2Bの発現が低下していることが確認された。このことから、CCI誘発NPにおいて、PSD-95依存的にNR2Bの発現が上昇することが明らかとなった。PSD-95がNPを調節する分子機構をさらに明らかにするために、CCIによって誘導されるCREBの活性化を検出した。その結果、PSD-95のノックダウンによってCREBの発現は変化しなかったが、そのリン酸化は抑制された。このことは、CREBがPSD-95の下流分子である可能性を示している。PSD-95ノックダウン後のNR2Bのダウンレギュレーションと合わせて、PSD-95とNR2BはCCI後に相互に依存的に活性化されると推察される。模式図をFig.6に示す。本研究の限界は、ACCにおけるPSD-95およびNR2BのNP調節機構が下行性促進経路の崩壊と関連しているかどうかを調査していないことである。

〇種々の神経因性疼痛モデル

〇痛みの基礎知識