Neuropsychopharmacology (2024) Published: 11 October 2024
Autism spectrum disorder-like behaviors induced by hyper-glutamatergic NMDA receptor signaling through hypo-serotonergic 5-HT1A receptor signaling in the prefrontal cortex in mice exposed to prenatal valproic acid (前頭前皮質における低セロトニン5-HT1A受容体シグナルを介した高グルタミン酸NMDA受容体シグナルによって誘発される自閉スペクトラム症様行動：妊娠中バルプロ酸曝露マウスの研究)
Hitomi Kurahashi 1, Kazuo Kunisawa 1 2, Kenji F Tanaka 3, Hisayoshi Kubota 1 2, Masaya Hasegawa 1, Mai Miyachi 4, Yuka Moriya 4, Yoichi Hasegawa 4, Taku Nagai 2, Kuniaki Saito 5 6 7, Toshitaka Nabeshima 2 6 7, Akihiro Mouri 8 9 10
Department of Regulatory Science for Evaluation & Development of Pharmaceuticals & Devices, Fujita Health University Graduate School of Health Science, Aichi, Japan
藤田医科大学医療科学部レギュラトリーサイエンス分野 毛利彰宏教授、倉橋仁美大学院生、國澤和生准教授、鍋島俊隆客員教授らと、慶應義塾大学 田中謙二教授、名城大学 守屋友加助教、長谷川洋一教授などによる共同研究チーム
セロトニンとグルタミン酸の相互作用による自閉スペクトラム症の新たな病態メカニズムを解明
Abstract
Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder characterized by repetitive behaviors, social deficits, and cognitive impairments. Maternal use of valproic acid (VPA) during pregnancy is associated with an increased risk of ASD in offspring. The prevailing pathophysiological hypothesis for ASD involves excitation/inhibition (E/I) imbalances and serotonergic dysfunction. Here, we investigated the association between glutamatergic-serotonergic neuronal interactions and ASD-like behaviors in mice exposed to prenatal VPA. Prenatal VPA exposure induced excessive repetitive self-grooming behavior and impaired social behavior and object recognition memory in young adult period. Prenatal VPA mice showed hyper-glutamatergic function (increase in basal extracellular glutamate levels and CaMKII phosphorylation) and hypo-serotonergic function (decrease in 5-hydroxyindoleacetic acid and stimulation-induced serotonin [5-HT] release, but an increase in 5-HT transporter expression) in the prefrontal cortex. Treatment with a low-affinity NMDA receptor antagonist (memantine), a selective 5-HT reuptake inhibitor (fluoxetine), and a 5-HT1A receptor agonist (tandospirone) attenuated both the increase in CaMKII phosphorylation and ASD-like behavior of prenatal VPA mice. Opto-genetic activation of the serotonergic neuronal system attenuated impairments in social behavior and object recognition memory in prenatal VPA mice. WAY-100635—a 5-HT1A receptor antagonist—antagonized the effect of fluoxetine on impaired social behavior and object recognition memory. These results suggest that E/I imbalance and ASD-like behavior are associated with hypo-serotonergic receptor signaling through 5-HT1A receptors in prenatal VPA mice.
要旨
自閉スペクトラム症（ASD）は、神経発達障害の一種であり、反復的な行動、社会性の欠如、認知障害を特徴とします。本研究は、妊娠中バルプロ酸（VPA）に曝露されたマウスを用いて、グルタミン酸作動性-セロトニン作動性ニューロン相互作用とASD様行動の関連を検討した。VPA曝露マウスでは、前頭前皮質における高グルタミン酸作動性機能と低セロトニン作動性機能が観察されました。治療として、低親和性NMDA受容体拮抗薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）、および5-HT1A受容体作動薬が有効であることが示された。
背景
妊娠中のバルプロ酸の使用は、子供の自閉症リスクを高めることが知られています。ASDの病態生理学的仮説には、興奮/抑制バランスの乱れやセロトニン作動性の機能不全が含まれる。本研究では、これらの仮説に基づき、ニューロン間相互作用がASD様行動にどのように寄与するかを調査した。
方法
- 動物モデル:
C57BL/6JマウスおよびTph2-tTA::tetO-ChR2(C128S)トランスジェニックマウスを使用した。妊娠中12.5日目（E12.5）にバルプロ酸（VPA）を腹腔内注射し、ASDモデルを作製した。 - 行動解析:
反復行動（グルーミング行動の回数と持続時間）、社会的相互作用時間、物体認識記憶（新規物体認識テスト）を測定した。また、運動活動および不安関連行動（オープンフィールドテスト、Y字迷路テスト）も評価した。 - 薬物治療:
低親和性NMDA受容体拮抗薬（メマンチン、10 mg/kg）、SSRI（フルオキセチン、20 mg/kg）、5-HT1A受容体作動薬（タンドスピロン、0.1 mg/kg）を行動テストの30分前に腹腔内投与した。 - 分子解析:
- リアルタイムRT-PCRを使用してセロトニン関連遺伝子（TPH2、SERT、MAO-A）の発現を測定した。
- ウエスタンブロッティングでCaMKIIやNMDA受容体のリン酸化状態を評価した。
- 微小透析により、前頭前皮質のグルタミン酸やセロトニンの放出量を測定した。
- 光遺伝学的解析:
背側縫線核（DRN）に光ファイバーを埋め込み、470 nmの光刺激でセロトニンニューロンを活性化した。この状態で行動テストを実施した。
結果
- ASD様行動の確認:
VPA曝露マウスでは以下の行動異常が確認された。- 反復行動: グルーミング行動の回数と持続時間が増加した。
- 社会性低下: 社会的相互作用時間が短縮した。
- 認知機能障害: 新規物体認識テストにおいて、物体認識の低下が観察された。
- 神経化学的変化:
- グルタミン酸系の異常: 前頭前皮質でのグルタミン酸濃度およびCaMKIIリン酸化が増加した。
- セロトニン系の異常: 前頭前皮質でのセロトニン代謝物（5-HIAA）および高カリウム刺激後のセロトニン放出が減少した。セロトニントランスポーター（SERT）発現の増加が確認された。
- 薬物効果:
- メマンチン: ASD様行動とCaMKIIリン酸化の増加を抑制した。
- フルオキセチン: 社会的相互作用と認知機能障害を改善したが、反復行動には効果がなかった。
- タンドスピロン: ASD様行動全般（反復行動、社会性低下、認知機能障害）とCaMKIIリン酸化の異常をすべて改善した。
- 光遺伝学的解析:
光刺激によるDRNのセロトニンニューロン活性化は、社会性低下と認知機能障害を改善したが、反復行動には効果がなかった。
議論
本研究では、妊娠中のバルプロ酸（VPA）曝露が、前頭前皮質（PFC）におけるグルタミン酸およびセロトニン作動性システムの相互作用異常を通じて、自閉スペクトラム症（ASD）様行動を引き起こすことを明らかにした。これにより、ASDにおける神経生物学的なメカニズムを解明するための重要な知見が得られた。
VPA曝露マウスのPFCでは、グルタミン酸作動性の過剰活動（高グルタミン酸濃度とCaMKIIリン酸化の増加）が観察された。これらの変化は、ASDにおける興奮/抑制（E/I）バランスの乱れが重要な病態メカニズムであるとする仮説を支持するものである。過去の研究では、ASD患者の脳内でグルタミン酸受容体やその輸送体の発現増加が報告されており、本研究の結果はそれらの報告と一致している。また、CaMKIIリン酸化がPFCの2/3層に局在していたことから、この領域のニューロン活動がASD様行動の中心的な役割を果たしている可能性が示唆された。このことは、ASD患者で報告されているPFCニューロンの過剰形成や接続性の異常と関連する可能性がある。
セロトニン作動性システムの観点では、PFCでのセロトニン代謝物（5-HIAA）の低下やセロトニントランスポーター（SERT）の発現増加が確認された。これにより、シナプス間隙のセロトニン濃度が減少し、結果として5-HT1A受容体の活性低下を引き起こしたと考えられる。5-HT1A受容体は、グルタミン酸放出を抑制する役割を持つため、この機能低下はグルタミン酸作動性システムの過剰活動をさらに助長した可能性がある。本研究では、SSRI（フルオキセチン）や5-HT1A受容体作動薬（タンドスピロン）の投与によって社会性や認知機能の改善が見られたが、反復行動には効果が限定的であった。このことから、セロトニン系の異常がASDの多面的な症状に異なる影響を与えることが示唆された。
また、光遺伝学的手法を用いて背側縫線核（DRN）のセロトニンニューロンを刺激した結果、PFCのセロトニン濃度が増加し、社会性および認知機能が改善された。これにより、DRNからPFCへのセロトニン系投射がASD様行動の調節に重要であることが確認された。しかし、反復行動には改善が見られなかった。この結果は、特定の受容体サブタイプ（例えば、5-HT2Bや5-HT2C）が反復行動の制御に寄与している可能性を示唆している。
治療戦略の観点からは、NMDA受容体拮抗薬（メマンチン）や5-HT1A受容体作動薬の併用が有望であると考えられる。メマンチンは、グルタミン酸系の過剰活動を抑制することでASD様行動を改善する一方、タンドスピロンはセロトニン系を介して同様の効果を発揮した。これらの薬剤の相乗効果を探ることが、将来的なASD治療薬開発において重要である。また、治療の個別化に向けて、ASD患者ごとの神経化学的プロファイルを評価することが求められる。例えば、セロトニン系の異常が主に関連する患者にはSSRIや5-HT1A受容体作動薬が有効であり、グルタミン酸系の異常が目立つ場合にはNMDA受容体拮抗薬が有用である可能性がある。
さらに、本研究の結果は、ASDにおける性差の重要性を浮き彫りにしている。VPA曝露マウスでは、オスで顕著なASD様行動が観察され、メスではその程度が軽微であった。この性差は、ASDの病態や治療戦略を考える上で考慮すべき重要な要素である。将来的には、性ホルモンの影響や性差に関連する分子機構を解明することで、より効果的な治療法の開発が期待される。
妊娠中のVPA曝露がPFCの神経化学的異常を通じてASD様行動を引き起こすメカニズムが明確になった。これにより、ASDの病態解明と新たな治療標的の発見に向けた貴重な知見が得られたといえる。