STAR PROTOCOL | SEPTEMBER 18, 2024
Protocol to process fresh human cerebral cortex biopsies for patch-clamp recording and immunostaining (パッチクランプ記録および免疫染色用の新鮮なヒト大脳皮質生検の処理手順)
Keimpe Wierda,1,2,5,* Hajnalka Nyitrai,1,3 Amélie Lejeune,1,3 Ine Vlaeminck,1,2 Elke Leysen,1,3 Tom Theys,3,4 Joris de Wit,1,3,** Pierre Vanderhaeghen,1,3,*** and Baptiste Libé-Philippot1,3,6,****
1VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, 3000 Leuven, Belgium
Summary
Cerebral cortex biopsies enable the investigation of native developing and mature human brain tissue. Here, we present a protocol to process human cortical biopsies from the surgical theater to the laboratory. We describe steps for the preparation of viable acute slices for patch-clamp recording using dedicated chemical solutions for transport and sectioning. We then explain procedures for tissue fixation and post hoc immunostaining to correlate physiological properties to morphological features and protein detection.
大脳皮質生検により、発達中のヒトの脳組織や成熟したヒトの脳組織の調査が可能となる。ここでは、手術室から研究室にヒトの大脳皮質生検を運ぶ際の処理手順を説明する。輸送と切片化に専用の化学溶液を使用し、パッチクランプ法による記録用の生存可能な急性スライスを準備する手順を説明する。次に、生理学的特性を形態学的特徴やタンパク質の検出と関連付けるための組織固定と事後免疫染色の手順を説明する。
ハイライト
- 手術室から研究室への生検輸送の準備
- 電気生理学的記録を行うための皮質生検の切片化
- パッチドニューロンの事後免疫染色による、その中のタンパク質の検出
- TSA蛍光増幅による、低レベルで産生されたタンパク質の免疫検出
要旨:
このプロトコルは、外科手術で取得したヒト大脳皮質生検を研究室でパッチクランプ記録および免疫染色に使用するための処理方法を提示している。まず、外科室から実験室への生検の輸送を準備し、その後、組織切片の作製や電気生理学的記録のための手順を詳細に説明している。さらに、免疫染色を通じて、神経細胞の生理学的特性と形態学的特性を関連付けるための具体的な方法を示している。
背景:
ヒトの大脳皮質生検は、発達中または成熟した脳組織を直接研究するために非常に有用である。このプロトコルでは、外科手術中に取得した生検を使用し、研究室での電気生理学的実験や免疫染色による解析を行う。組織を適切に保存し、実験に適した状態にするためには、輸送から記録までの各ステップを正確に行う必要がある。特に、組織の生理学的特性を維持しながら、生物学的機能を調べることができることが重要である。
Methods:
- 輸送準備:
外科手術後、迅速に実験室に運搬できるよう、特殊な炭酸ガスで飽和させた輸送溶液を用いて、生検を氷上で運搬する。輸送時間は5〜10分以内に制限する。 - 組織の切片作製:
ビブラトームを用いて、250〜300µmの厚さで大脳皮質の急性切片を作製する。切片は冷却されたカーボジェン（5% CO2/95% O2）で飽和させた切片溶液中で処理され、記録前に回復させる。 - パッチクランプ記録:
取得した急性切片を用いて、パッチクランプ記録を行う。記録は、3 mMのバイオチンを含む内部溶液を使用して行い、後の免疫染色で神経細胞の同定が可能である。 - 固定と免疫染色:
記録が終了した切片は、冷たいPFA（パラホルムアルデヒド）溶液で固定し、その後PBSで洗浄する。ポストホックでの免疫染色により、電気生理学的特性と形態学的特徴、およびタンパク質の発現を関連付けることができる。
Results:
このプロトコルに従うことで、ヒト大脳皮質の生検をパッチクランプ記録や免疫染色に使用可能な状態に処理できる。記録した神経細胞の生理学的データと、その形態やタンパク質発現の関連性を調べることができ、ヒト脳の発達や疾患に関する洞察を得ることができる。
Discussion:
ヒトの脳組織は、そのサイズや特性がマウスなどの実験動物とは異なるため、電気生理学的な記録においては特定の注意が必要である。ヒトの神経細胞は一般的にマウスの細胞よりも大きく、刺激プロトコルや記録の条件を調整する必要がある。また、免疫染色の際には、タンパク質発現が少ない場合にTSA（チラミドシグナル増幅）法を使用して信号を増幅させる技術が用いられている。本プロトコルは、ヒトの大脳皮質組織に対して、パッチクランプ記録と免疫染色を組み合わせて実施する方法を示しており、従来の動物モデルでは得られなかった人間特有の神経生理学的な特徴の解析を可能にしている。特に、発達過程や疾患の影響を直接ヒト脳組織で調査できる点が新規性となっている。このプロトコルは、他の脳領域や病理組織には最適化されておらず、長時間の輸送が必要な場合にはさらなる改良が必要である。また、TSA法は定量的な免疫検出には適していないため、細胞構造の細かい解析には制限がある。
応用可能性:
本プロトコルは、ヒトの脳組織を用いた神経科学研究に応用でき、特に脳の発達過程や神経疾患のメカニズム解明に有用である。また、パッチクランプ記録と免疫染色の組み合わせにより、神経細胞の生理学的特性と分子特性の関連性を詳細に調べることができる。
Dans la serre de la classe Fleurit la plus belle orchidée Aux parfums et couleurs intenses
Mais le vent souffle La fenêtre s’ouvre L’orchidée devient graine volante
Délaissant le champ labouré En quête de terres inconnues Le jeune talent s’envole
Mes paumes deviennent Une terre asséchée Perdant toute humidité
La lumière d’antan Soleil qui éclairait la serre Se couche dans un ciel lointain
Ne restent que Un parfum éphémère Et une esquisse délavée
Qu’en terres lointaines De nouvelles racines s’ancrent Et que s’épanouisse la fleur
Je le souhaite Tandis que mon jardin Demeure dans la solitude
Point of no return Le battement d’ailes du papillon Ne reviendra jamais
La Graine Voyageuse