Int J Mol Sci. 2024 May 17;25(10):5480. doi: 10.3390/ijms25105480.
PolyI:C Maternal Immune Activation on E9.5 Causes the Deregulation of Microglia and the Complement System in Mice, Leading to Decreased Synaptic Spine Density (E9.5でのPolyI母体免疫活性化がマウスにおけるミクログリアおよび補体系の調節不全を引き起こし、シナプススパイン密度の減少につながる)
Shuxin Yan 1, Le Wang 1 2, James Nicholas Samsom 1, Daniel Ujic 1 3, Fang Liu 1 3 4 5
Campbell Family Mental Health Research Institute, Centre for Addiction and Mental Health, 250 College St., Toronto, ON M5T 1R8, Canada.
Abstract
Maternal immune activation (MIA) is a risk factor for multiple neurodevelopmental disorders; however, animal models developed to explore MIA mechanisms are sensitive to experimental factors, which has led to complexity in previous reports of the MIA phenotype. We sought to characterize an MIA protocol throughout development to understand how prenatal immune insult alters the trajectory of important neurodevelopmental processes, including the microglial regulation of synaptic spines and complement signaling. We used polyinosinic:polycytidylic acid (polyI:C) to induce MIA on gestational day 9.5 in CD-1 mice, and measured their synaptic spine density, microglial synaptic pruning, and complement protein expression. We found reduced dendritic spine density in the somatosensory cortex starting at 3-weeks-of-age with requisite increases in microglial synaptic pruning and phagocytosis, suggesting spine density loss was caused by increased microglial synaptic pruning. Additionally, we showed dysregulation in complement protein expression persisting into adulthood. Our findings highlight disruptions in the prenatal environment leading to alterations in multiple dynamic processes through to postnatal development. This could potentially suggest developmental time points during which synaptic processes could be measured as risk factors or targeted with therapeutics for neurodevelopmental disorders.
母体免疫活性化（MIA）は、複数の神経発達障害の危険因子である。しかし、MIAのメカニズムを探るために開発された動物モデルは、実験的要因に敏感であり、そのためMIAの表現型に関するこれまでの報告は複雑であった。われわれは、出生前免疫障害が、樹状突起スパインのミクログリアによる監視と制御や補体シグナル伝達を含む、重要な神経発達過程の軌跡をどのように変化させるかを理解するために、発生を通してMIAプロトコルの特徴を明らかにしようとした。我々は、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（polyI:C）を用いて、CD-1マウスの妊娠9.5日目にMIAを誘発し、シナプス棘(樹状突起スパイン)密度、ミクログリアのシナプス刈り込み、補体タンパクの発現を測定した。その結果、体性感覚皮質の樹状突起スパイン密度が生後3週目から減少し、ミクログリアのシナプス刈り込みと貪食が増加していることがわかった。さらに、補体タンパク質の発現異常は成人期まで持続することが示された。今回の研究結果は、出生前の環境の乱れが、出生後の発達に至るまで、複数のダイナミックな過程に変化をもたらすことを浮き彫りにした。このことは、神経発達障害の危険因子として、あるいは治療薬の標的として、シナプス形成過程を測定できる発達時点を示唆する可能性がある。
Keywords: complement; dendritic spine density; maternal immune activation; microglia; synaptic pruning.
Background
妊娠中の感染が、子供の神経発達障害のリスクを増加させる可能性があるという観察は、長い間注目されてきた問題である。特に、季節性の感染症の流行と神経発達障害の増加が一致しているという初期の疫学的観察が、この分野の研究を進展させるきっかけとなった。最近のメタアナリシスでは、妊娠初期の感染や発熱が、自閉症スペクトラム障害（ASD）や統合失調症、注意欠陥・多動性障害（ADHD）など、複数の神経発達障害のリスクを増加させることが示されている。また、感染症に限らず、糖尿病やリウマチ、その他の自己免疫疾患などによる非感染性の免疫活性化も、これらの障害のリスク要因として知られている。このように、胎児の発達の重要な時期における免疫活性化が、脳の発達経路を恒久的に変える可能性があると考えられている。
Introduction
母体免疫活性化（MIA）モデルは、母体の免疫応答が胎児の発達にどのように影響するかを直接研究するための有力な手段である。MIAを誘導するためには、さまざまな免疫原が使用されており、その中でも、ウイルス二本鎖RNAを模倣するポリイノシン酸:ポリシチジル酸（PolyI
）は、一般的に用いられる選択肢である。MIAによる影響は、統合失調症、不安障害、自閉症スペクトラム障害（ASD）に関連する行動の変化として現れることが知られている。しかし、MIAのプロトコルにはさまざまなバリエーションがあり、その結果として報告される結果が一貫しないことが課題となっている。例えば、マウスの妊娠日E9におけるPolyI
の曝露は、統合失調症に関連する反射行動であるプレパルス抑制（PPI）の欠損を引き起こし、前頭前皮質のドーパミンD1受容体の発現を減少させるが、妊娠日E17の曝露ではこれらの影響が見られないことが報告されている。また、MIAによる影響は、曝露のタイミングにより異なることも示唆されている。
脳の常駐免疫細胞であるミクログリアは、神経発達において重要な役割を果たしており、MIAによる免疫調節異常と神経学的結果との間の重要なリンクとなる可能性がある。ミクログリアは、発達初期（E9.5）に脳に定着し、その後ゆっくりと置き換えられるため、初期の異常がその後の発達に持続的な影響を与える可能性がある。ミクログリアは、ニューロンの増殖と生存を支援するだけでなく、食作用やトロゴサイトーシスなどのメカニズムを介してシナプスの「刈り込み」を行い、シナプスの発達に重要な役割を果たす。統合失調症やASDにおけるシナプス伝達の機能不全は重要な特徴であり、MIAモデルでもシナプススパイン密度の変化が再現されている。しかし、スパイン密度が増加するか減少するかは、脳の部位や性別、MIAプロトコルによって異なることが指摘されている。
ミクログリアによるシナプス刈り込みは、C1qやC3などの補体タンパク質を介して調節されている。これらの補体タンパク質は、シナプスを除去するための標的として識別し、ミクログリアがそのシナプスを食作用によって除去するメカニズムに関与している。C3、C1q、C4欠損マウスでは、視床膝状体核におけるシナプス除去が阻害され、シナプススパイン密度が増加することが示されている。また、C4の過剰発現はスパイン形成異常を引き起こすことが知られている。
これまでのMIAに関する研究は、通常、生後早期または成人期における影響を測定するにとどまり、行動変化が顕在化する前の発達過程でどのように重要な神経発達過程が進行するかを追跡していない。したがって、行動障害につながる発達経路を明らかにするためには、発達の異なる段階でこれらのプロセスの異常を追跡することが重要である。
Results
本研究では、E9.5におけるPolyIを用いた母体免疫活性化（MIA）が、子孫の神経発達にどのように影響するかを調査した。その結果、MIAによるシナプススパイン密度の減少、ミクログリアによるシナプス刈り込みの増加、および補体タンパク質の異常発現が確認された。
- シナプススパイン密度の減少
MIAを受けたマウスの子孫では、3週齢からシナプススパイン密度が顕著に減少した。この減少は生後2週齢（wo）では見られなかったが、3週齢（t(765) = 8.45, p < 0.00001, d = 1.18）から12週齢（t(765) = 6.67, p < 0.00001, d = 1.17）まで持続的に観察された。対照群のマウスでは、3週齢から8週齢にかけてシナプススパイン密度が増加したが、MIA群では2週齢以降、スパイン密度が減少し続けた。 - ミクログリアによるシナプス刈り込みの増加
MIAを受けたマウスの子孫では、ミクログリアによるシナプス刈り込みが増加した。特に、3週齢（t(221) = 2.72, p = 0.021, d = 0.79）、6週齢（t(221) = 6.53, p < 0.00001, d = 1.74）、8週齢（t(221) = 3.98, p = 0.00024, d = 1.34）で有意な増加が見られた。これにより、MIAがミクログリアの活性を異常に促進し、過剰なシナプス刈り込みを引き起こしている可能性が示唆された。 - ミクログリアの貪食活動の増加
MIA群では、ミクログリアの貪食活性を示すCD68タンパク質の発現も有意に増加した。特に、3週齢（t(226) = 4.20, p < 0.00001, d = 1.24）、6週齢（t(226) = 11.13, p < 0.00001, d = 2.90）、8週齢（t(226) = 6.44, p < 0.00001, d = 1.92）、および12週齢（t(226) = 4.39, p < 0.00001, d = 1.36）で顕著な増加が確認された。これらの結果は、MIAがミクログリアの貪食活動を異常に高め、シナプス刈り込みを促進する可能性を示唆している。 - 補体タンパク質の異常発現
補体系のC1qおよびC4タンパク質の発現がMIA群で異常に増加した。C1qは8週齢で有意に増加（t(7.5) = −3.45, p = 0.049, d = −2.18）、C4も8週齢で有意に増加（t(7.2) = −5.48, p = 0.0043, d = −3.47）した。また、C4のα鎖も12週齢で有意ではないものの増加傾向が見られた（t(6.0) = −2.94, p = 0.026, padj = 0.13, d = −2.08）。この異常発現は、MIAが補体系を介したシナプス刈り込みの異常を引き起こしている可能性を示している。
これらの結果は、母体免疫活性化が子孫の神経発達に深刻な影響を与え、特にシナプススパイン密度の減少とミクログリアおよび補体系の異常が神経発達障害のリスクを増加させる可能性を示唆している。
Discussion
本研究では、母体免疫活性化（MIA）が神経発達に与える影響について、得られた結果を基に詳細に議論を行った。
- シナプススパイン密度の減少の複雑さ
MIAによるシナプススパイン密度の減少は、神経発達障害にどのように影響するかが複雑であると考えられる。本研究では、MIAがスパイン密度の減少を引き起こしたが、他の研究ではスパイン密度が増加する場合もあることが報告されている。この違いは、マウスの系統やMIAプロトコルの違い、さらには性別やシナプスのタイプによって異なる可能性がある。これにより、MIAが一方向的な影響を与えるのではなく、その影響が複雑で多岐にわたることが示唆される。 - ミクログリアの異常な活動とシナプス刈り込み
本研究の結果は、MIAがミクログリアの異常な活性化を引き起こし、これが過剰なシナプス刈り込みにつながる可能性があることを示している。特に、シナプススパイン密度の減少が観察される一方で、ミクログリアによるシナプス刈り込みと貪食活動の増加が確認された。このことは、MIAがミクログリアの活動を異常に促進し、その結果、神経発達において重要な役割を果たすシナプスの過剰な除去が引き起こされる可能性を示唆している。 - 補体系の異常発現
本研究では、補体系のC1qおよびC4タンパク質の異常発現が確認された。これらの異常は、MIAが補体系を介したシナプス刈り込みの異常を引き起こしている可能性を示している。補体系の異常発現がシナプススパイン密度の減少やミクログリアの異常活動とどのように関連しているかについては、さらなる研究が必要であるが、これらの結果は補体系が神経発達障害の発症に寄与するメカニズムの一端を明らかにするものである。 - 神経発達障害のモデルとしてのMIAの重要性と限界
MIAは、神経発達障害の環境要因を理解するための重要なモデルであるが、その影響は微妙な実験条件の違いに非常に敏感である。本研究のプロトコルでは、スパイン密度の減少や補体C4の活性化が観察され、これが統合失調症のモデルとして適している可能性が示される。しかし、MIAが神経発達に与える影響は非常に複雑であり、さらなる研究が必要である。 - 治療および将来の研究への示唆
本研究の結果から、MIAが引き起こす異常が青年期後期から成人期初期にピークを迎えることが示唆された。この時期における治療介入が、MIAによる神経発達障害を予防または治療する可能性がある。特に、ミクログリアの活性や炎症を調節する治療が有効である可能性が考えられる。また、青年期後期における神経炎症やシナプス調節のバイオマーカーが、将来的に神経発達障害のリスク予測に役立つ可能性がある。
